BioProcess Analytics | BPA - 解决方案 | 关于测定蛋白浓度时准确消光系数的重要性

蛋白药物制造需要严格的质量控制（QC）和分析精度。一个关键方面是在生产的各个阶段准确测定蛋白浓度，包括上游和下游的工艺控制以及活性物质（Drug Substance, DS）和成品制剂（Drug Product, DP）的放行。蛋白浓度影响最终产品的安全性、有效性和功能性，使精确测量对法规合规性、质量保证（QA）和产品一致性至关重要。本文中，我们关注紫外（UV）光谱法，这是一种常用的测定蛋白质浓度的方法，依赖于准确的消光系数。文中的一个案例研究，说明了使用不准确的消光系数进行蛋白质浓度测定的影响。

UV光谱法是一种强大且广泛使用的方法，用于测量蛋白浓度，提供了速度、无损、成本效益、试剂使用少和高灵敏度等几个优势。该技术的宽范围、自动化能力和处理小样本量的能力使其非常适合制造过程的控制。虽然不适合每种蛋白质或样本条件（例如，杂质样本或缺乏芳香族氨基酸的样本），但UV光谱法仍然是蛋白质定量中的一个有价值的工具。测量蛋白质浓度的其他方法（例如Lowry测定法、Bradford方法、荧光染料法和高效液相色谱法HPLC）在特异性方面具有优势，但它们复杂且在制造中使用的某些基质而受限。

UV光谱法在280 nm处测量蛋白浓度。该波长主要由芳香族氨基酸如色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸以及蛋白质中的双键吸收。280 nm处的吸光度只有在与蛋白质的消光系数结合解释时才有意义。消光系数使吸光度数据转换为蛋白质浓度成为可能。UV光谱法依赖于比尔-朗伯定律，该定律建立了样本吸光度与浓度之间的关系：A = εlc（公式1）。其中，A是吸光度，ε是摩尔消光系数（M⁻¹cm⁻¹），l是比色皿的光程（cm），c是蛋白浓度（M）。比尔-朗伯定律表明吸光度与浓度和光程直接成比例。消光系数（ε）反映了蛋白质在特定波长下吸收光的内在能力。从测量的吸光度计算蛋白质浓度依赖于蛋白质特定的消光系数（摩尔吸收率）和比尔-朗伯定律。前述方程中的M（mol/L）单位可以根据蛋白质的分子量转换为mg/mL。以mg/mL报告蛋白质浓度是过程和放行测试中的常见做法。

然而，如果没有已知或准确计算的消光系数，吸光度读数无法转换为浓度。这强调了消光系数在光谱蛋白质测定中的重要性。分析人员可以采取多种方法来估计（理论）或确定（实验）蛋白质的消光系数。理论估计：消光系数可以根据氨基酸序列——特别是280 nm处吸收的色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和二硫键来估计。理论值可以使用公式2计算：

ε₂₈₀= (nWx5500)+(nYx1490)+(nCx125)

W：⾊氨酸

Y：酪氨酸

C：半胱氨酸

n：蛋⽩质中存在的每个残基的数量

该计算方法在蛋白质氨基酸序列已知但纯化尚未完成时非常有用。此外，一些在线工具（如ProtParam程序）可以采用蛋白质氨基酸序列并使用上述方程计算其理论消光系数。尽管这种方法通常用于建立消光系数，但几个因素可能会干扰计算的准确性——例如，蛋白质折叠和构象（芳香族残基的可及性）、磷酸化和糖基化以及样本纯度——导致低估或高估。实验测定：有几种方法可以用来确定蛋白质的消光系数，包括氨基酸分析、凯氏氮测定、干重法和Edelhoch方法。Edelhoch方法因其准确性、简单执行和高重复性而被推荐。

最近的一项研究中，Batabyal等人通过Edelhoch方法确定了实验消光系数值，并将其与一系列生物治疗蛋白的理论值进行了比较。在九种单克隆抗体（mAbs）中，团队发现实验值与理论值之间的最大偏差为4.7%，实验值低于理论值。这些结果表明，实验和理论消光系数在一系列消光系数范围内是一致的。实际意义是，消光系数可以容易计算，以通过280 nm处的吸光度来确定蛋白浓度，而不需要实验工作。该研究还报告了mAbs在1.39 - 1.66 (mg/mL)⁻¹cm⁻¹范围内的消光系数范围。这些数据表明mAbs之间的变异性；因此，在所有情况下使用单一“标准”值是不适当的。

为了说明这一点，我们提出了以下案例研究，基于最近的一个项目。它涉及将符合良好生产规范（GMP）的DS转换为在不同CMO的用于美国临床试验I期的DP。该治疗药物是一种mAb，配方为预期浓度为100 mg/mL。DP过程包括无菌过滤步骤，然后是玻璃瓶灌装。在DS放行期间，发现使用了通用的mAbs消光系数值1.4 (mg/mL)⁻¹cm⁻¹，而不是产品特定的消光系数。如上所述，这种方法不准确。使用Expasy ProtParam工具对客户mAb进行理论消光系数计算，发现消光系数为1.6 (mg/mL)⁻¹cm⁻¹。在回顾DS制造过程时，蛋白浓度在最终超滤-透析（UF/DF）稀释步骤和DS放行中确定。使用不可知的消光系数计算的原始蛋白浓度为103 mg/mL。使用修正的产品特定消光系数，浓度为89 mg/mL，超出了100 ± 10 mg/mL的放行规格。DS浓度的变化影响了技术转移和临床使用的多个方面，如表1所示。

表1、工业案例研究中活性物质（DS）浓度变化对技术转移和临床使用参数的影响总结；CoA = 分析证书，CMO = 合同生产组织，DP = 成品制剂，HCP = 宿主细胞蛋白

参数	影响
毒理学研究剂量	浓度降低导致单次给药体积增大；毒理学研究方案相应更新。
DS批次记录	柱载量和池浓度的结果低于原始记录值。
病毒清除	因池浓度低于原始记录值，可能影响病毒清除研究。研究前更新了池体积。
DS质量标准	需建立新的内部DS质量标准，更新蛋白浓度标准为 90 ± 10 mg/mL。原标准由CMO持有且因合同结束无法修改。
DS分析证书（CoA）	生成技术报告以记录其他使用错误蛋白浓度的分析结果的影响。残留蛋白A和HCP的结果按每毫克计，并用新浓度重新计算。生成内部CoA以支持新CMO接收DS。
DP质量标准	采用新的DP蛋白浓度标准 90 ± 10 mg/mL；变更在新CMO及相关DP批次批准前确认。
分析方法转移/验证	新CMO需备忘录以更新验证样品和参考标准的蛋白浓度。文件修正导致方法验证延迟。
DP灌装体积	为维持相同毫克/瓶目标，增加灌装体积。变更以修订形式加入已批准的生产批次记录。
DP产量	因灌装体积增加，所需瓶数减少。
临床使用	注射给药体积增加。持续更新临床给药策略及可给药患者数。可给药患者数减少。

尽管使用不正确的消光系数的影响很大，但在临床DP灌装到小瓶之前解决了蛋白浓度的变化。对规格和分析证书（CoA）进行了更新，因为材料是为临床试验I期生成的，尚未提交研究性新药（IND）申请。如果在开发后期发现不准确性，从临床和监管角度来看，影响可能是显著的。上述案例研究强调了测量生物治疗蛋白浓度的一个关键方面，并展示了使用不准确消光系数的风险。通过确保使用正确的消光系数，可以实现准确和可重复的蛋白浓度测量，这对于成功的药物开发至关重要。希望这个例子能为开发您的蛋白质浓度分析方法提供见解，并防止您下一个项目中忽略消光系数。

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